🐮 👼🏽 ✍🏼 व्यावहारिक जैव सूचना विज्ञान, भाग 3। प्रायोगिक डेटा के महत्व का आकलन 🏴 🍦 👨🏿‍🚒

प्रयोग के प्रत्येक चरण में, सामग्री की तैयारी से शुरू करना, पीसीआर के साथ जारी रखना और अनुक्रमण के साथ समाप्त होना, त्रुटि का एक संचय होता है। हमें परिणाम के महत्व का आकलन करने के लिए एक तंत्र की आवश्यकता है। इस बात की संभावना क्या है कि जीनोम के एक निश्चित हिस्से में पाए जाने वाले रीड्स आकस्मिक नहीं हैं? इस लेख में प्रस्तुत दृष्टिकोण डीएनए-सीक का उपयोग करके प्राप्त आंकड़ों पर लागू होता है, और मूल्यांकन के लिए पॉइसन वितरण का उपयोग करने की संभावना के बारे में बात करता है।

यह दृष्टांत योजनाबद्ध रूप से अनुक्रमण के लिए सामग्री तैयार करने की प्रक्रिया को दर्शाता है। प्रत्येक चरण में, एक गलती संभव है, जिसके परिणामस्वरूप जीनोम के एक मनमाना भाग पर एक रीड होता है।

A.1 प्रोटीन को बेहतर ढंग से ठीक करने के लिए एक डीएनए सेल को फार्मलाडेहाइड से उपचारित किया जाता है। फिर अल्ट्रासाउंड सहित विभिन्न तरीकों से डीएनए को टुकड़ों में काट दिया जाता है।
A.2-3 एक एंटीबॉडी जो प्रोटीन के प्रति संवेदनशील होती है, को जोड़ा जाता है। प्रोटीन के साथ चिह्नित टुकड़े एंटीबॉडी से जुड़े होते हैं। कुछ अंश अनियमित रूप से जुड़ते हैं।
A.4 डीएनए के टुकड़े के साथ एंटीबॉडी की वर्षा होती है। एंटीबॉडी और प्रोटीन से डीएनए के टुकड़ों की शुद्धि।
B.1-4 ये अनुच्छेद अनुक्रमण के लिए प्राप्त डीएनए अंशों को तैयार करने के चरणों को दर्शाते हैं। विशेष एडेप्टर जोड़ना। पीसीआर का उपयोग करके गुणन। एक स्लाइड पर रखकर।

परिणामस्वरूप स्लाइड को अनुक्रमण मशीन, जैसे इलुमिना में रखा गया है। उपकरण के संचालन और उससे जुड़े कार्यक्रमों का परिणाम एक FASTA / FASTQ फ़ाइल है। यहाँ FASTQ फ़ाइल की सामग्री का एक उदाहरण है:

@HWI-XXXXX_0470:1:1:1761:946#0/1 NCCCTTTGGATTTGTCCTTTCAGATGCATTAGCCAT +HWI-XXXXX_0470:1:1:1761:946#0/1 BKNNJMHHEJRTRRR_______________Y[[[Y_

पहली लाइन "@" से शुरू होती है और तीसरी लाइन "+" से शुरू होती है, यह वर्णनात्मक होती है, इसमें एक नाम, स्लाइड नंबर, आदि होते हैं। दूसरी पंक्ति न्यूक्लियोटाइड्स का पढ़ा अनुक्रम है, हमारे मामले में उनमें से 36 हैं। चौथी पंक्ति न्यूक्लियोटाइड्स को पढ़ने की संभावनाएं हैं। नीचे फ़ाइल प्रारूप के सटीक विवरण का एक लिंक है और http://en.wikipedia.org/wiki/FASTQ_format के अल्फ़ाबेटिक प्रतिनिधित्व से संख्या कैसे प्राप्त करें।
सभी पठन के साथ एक फ़ाइल, जो लाखों एकल अनुक्रमण में होती है, को बाउटी कार्यक्रम में स्थानांतरित किया जाता है , जो वर्तमान में सबसे तेज़ है। बाउटी कार्यक्रम की निष्पादन रेखा निम्न हो सकती है:

 /usr/src/bowtie-0.12.7/bowtie -q -v 2 -m 1 --best --strata -p 8 -S \ /usr/src/bowtie-0.12.7/indexes/hg19 - | samtools view -Sb - >${DIRNAME}/${SEQNAME}.bam

उदाहरण में निर्दिष्ट पैरामीटर निम्नलिखित कार्यक्रम व्यवहार की विशेषता है:
-q - इनपुट फ़ाइल को FASTQ मानता है, FASTA के रूप में नहीं
-v - पढ़ने में अनुमत त्रुटियों की संख्या, उपरोक्त उदाहरण में 2 हैं
-एम - इस मामले में देखने के लिए जीनोम में कितनी प्रविष्टियां (पढ़ी जाती हैं) 1
-p - कितने थ्रेड्स का उपयोग करने के लिए, मैं प्रोसेसर कोर की संख्या से आगे बढ़ा - 8
-S - का अर्थ है कि आउटपुट फ़ाइल .sam प्रारूप में लिखी जाएगी
/usr/src/bowtie-0.12.7/indexes/hg19 - प्री-इंडेक्स किए गए जीनोम के लिए पथ, जो बॉलटी-बिल्ड द्वारा किया जाता है। साथ ही, तैयार पथ को इंटरनेट से डाउनलोड किया जा सकता है।
- (दूसरी पंक्ति के अंत में डैश) का अर्थ है समतुल कार्यक्रम के प्रसारण के लिए मानक आउटपुट, जो मक्खी पर इसे tobam में परिवर्तित करता है।
विवरण में, मैंने पैरामीटर --best --strata को छोड़ दिया, जो कि बॉटी ऑपरेशन के विशेष मोड को सेट करता है: यदि प्रोग्राम जीनोम में रीड की एक से अधिक घटनाओं को एक अलग संख्या में त्रुटियों के साथ पाता है, तो यह कम से कम त्रुटि के साथ परिणाम प्रदर्शित करता है। यदि सबसे छोटी त्रुटि वाले परिणाम एक से अधिक हैं, तो वे प्रदर्शित नहीं होते हैं। यह कार्यक्रम के संचालन समय को बढ़ाता है, लेकिन साथ ही यह जीनोम में रीड्स की उपस्थिति की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए संभव बनाता है। यहाँ एक .sam / .bam फ़ाइल से एक उदाहरण आउटपुट है:

 @HD VN:1.0 SO:unsorted @SQ SN:chr10 LN:135374737 @SQ SN:chr11 LN:134452384 … @PG ID:Bowtie VN:0.12.7 CL:"/usr/src/bowtie-0.12.7/bowtie -q -v 1 -m 1 --best --strata -p 8 -S" USI-EAS21_8_3445_7_1_452_540 0 chr5 39195556 255 23M * 0 0 CTCCAGATTCTCTGGAAAGATGG SSSSSSPSSSSSSSSGNNSJSSL XA:i:0 MD:Z:23 NM:i:0 USI-EAS21_8_3445_7_1_170_242 0 chr14 73509925 255 23M * 0 0 CTGCATTAGACCTAGGCTTAGAA SSSSSSSSSSSSSSSSSSSGSNN XA:i:0 MD:Z:23 NM:i:0 USI-EAS21_8_3445_7_1_290_985 0 chr7 142613233 255 23M * 0 0 AGCTGACTGGCAAGCAACAGAGT JSSSSSSSSSSSPSSGSSLSNSL XA:i:0 MD:Z:23 NM:i:0 USI-EAS21_8_3445_7_1_881_711 4 * 0 0 * * 0 0 ATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTC SSSSPSSSSSSSSSSSSSSSSNS XM:i:0 USI-EAS21_8_3445_7_1_897_318 0 chr3 50101427 255 23M * 0 0 GGGCGCAGAACCGCTGCTGCTGC SPSSSSSSSPPSSSSNSPPPLSL XA:i:1 MD:Z:15A7NM:i:1

शीर्षलेख (@SQ, @HD, @PG के साथ शुरू होने वाली पंक्तियों) में विवरण होते हैं: गुणसूत्रों के नाम और उनकी लंबाई, चाहे फ़ाइल को क्रमबद्ध किया गया हो, वह कमांड जिसके साथ फ़ाइल प्राप्त हुई थी। शरीर में लाइनें होती हैं, प्रत्येक पंक्ति एक रीड होती है, लेकिन जीनोम में निर्देशांक के साथ। आप यहाँ और अधिक विस्तार से पढ़ सकते हैं http://genome.sph.umich.edu/wiki/SAM ।

जीनोम पर वितरण अलग-अलग हो सकता है, लेकिन समृद्ध क्षेत्रों में यह माना जाता है कि वितरण के निम्नलिखित गुण होने पर प्रयोग सफल होने की अधिक संभावना थी: यहां तक कि कवरेज, उच्च जटिलता, कवरेज की निरंतरता। जीन को कैसे कवर किया जा सकता है इसका उदाहरण ऊपर दिए गए आंकड़ों में दर्शाया गया है।

समृद्ध साइटों को निर्धारित करने के लिए, हम निम्नलिखित तर्क का उपयोग करते हैं। गुणसूत्रों की सभी लंबाई जोड़ें और दोहराए जाने वाले वर्गों की लंबाई घटाना (hg19 के लिए अनुमानित लंबाई 2282603114), परिणामी लंबाई को जी के रूप में लें लंबाई में जी को डब्ल्यू की चौड़ाई के साथ खिड़कियों में विभाजित करें (उदाहरण के लिए 500)। हम एन के लिए परिणामी खिड़कियों की संख्या (जी / डब्ल्यू लगभग 4565206.228) लेते हैं। हम प्रयोग में रीड्स की संख्या की गणना करते हैं जो सफलतापूर्वक जीनोम में पाए गए थे (इसे 4.5E6 में से 4E6 होने दें), एस के रूप में उनकी संख्या लें। फिर प्रति विंडो में औसत रीड की संख्या, हम दर्शाते हैं lamda

होगा

= एस * डब्ल्यू / जी = एस / एन।
पॉसन वितरण पॉइसन डिविटेशन

घटनाओं की ज्ञात औसत उत्पत्ति के साथ समय की अवधि में घटनाओं की दी गई संख्या k की उत्पत्ति की संभावना व्यक्त करता है। संचयी पॉइसन वितरण, k की घटनाओं के होने की संभावना को व्यक्त करेगा। हम संचयी वितरण का उपयोग करेंगे, क्योंकि हम इस संभावना में रुचि रखते हैं कि विंडो में रीड की संख्या k से कम हो। अशक्त परिकल्पना: k एक खिड़की में बेतरतीब ढंग से पढ़ता है। वैकल्पिक परिकल्पना: विंडो में k रीड्स आकस्मिक नहीं हैं। संभावना है कि हमारी अशक्त परिकल्पना सच है संचयी कविता वितरण

। करीब पी (के, lamda

) को 0, कम संभावना है कि रीड ने गलती से दी गई खिड़की को मारा। हमारे उदाहरण में, हम पाते हैं कि यदि विंडो में रीड की संख्या 15 तक है, तो 1-P (15.0.876193) = 2.55351E-15, अर्थात्। 500 की चौड़ाई के साथ एक विंडो में, 15 तक रीड की संख्या 2.55351E-15 की संभावना के साथ मौका पा सकती है। इस संख्या को p मान भी कहा जाता है। इसलिए, यदि 15 से अधिक रीड हैं, तो वे दुर्घटना से खिड़की में गिरने की संभावना भी कम हैं। इस प्रकार, स्थिति कार्यक्रम में सेट की जा सकती है: यदि p मान <= 1.e16, तो खिड़की में मिला डेटा विचार के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए, बाकी को छोड़ दिया जाना चाहिए।

निम्नलिखित एक उदाहरण कार्यक्रम है जो पिछले लेख में वर्णित कक्षाओं के हिस्से का उपयोग करता है और नए पॉइसहैंडलर वर्ग द्वारा पूरक है। पहले संग्रह की अतिरिक्त फाइलें यहां डाउनलोड की जा सकती हैं । नई पॉइसन डायरेक्टरी में, qmake टाइप करें, फिर बनाएं। संकलित पॉइज़न प्रोग्राम प्रत्येक जीन के ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट के पीछे स्थित 500bp पर खिड़कियों के लिए एक महत्व तालिका बनाता है, एनोटेशन को ब्राउज़र जीनोम से चुना जाता है। हम एक अन्य लेख में ब्राउज़र जीन के साथ अधिक विस्तृत काम पर विचार करेंगे। अगला, .bam फ़ाइल जो हमारी विंडो में मिलती है, से पढ़ी जाती है, उनके लिए पॉइसन वितरण बनाया जाता है। परिणाम एक फ़ाइल के लिए लिखा है।

PoissonHandler.hpp

 #ifndef PoissonHandler_H #define PoissonHandler_H #include <config.hpp> class PoissonHandler : public QState { Q_OBJECT private: GenomeDescription *sql_input; GenomeDescription *sam_input; QSettings setup; public: PoissonHandler(GenomeDescription *sql,GenomeDescription *sam,HandledData &output,QState *parent=0); ~PoissonHandler(); protected: virtual void onEntry(QEvent* event); }; #endif //

PoissonHandler.cpp

 #include "PoissonHandler.hpp" //------------------------------------------------------------- //------------------------------------------------------------- PoissonHandler::~PoissonHandler() { } //------------------------------------------------------------- //------------------------------------------------------------- PoissonHandler::PoissonHandler(GenomeDescription *sql,GenomeDescription *sam,HandledData &,QState * parent): QState(parent), sql_input(sql), sam_input(sam) { } //------------------------------------------------------------- //------------------------------------------------------------- void PoissonHandler::onEntry(QEvent*) { if(!setup.contains("AvgTagWindow")) setup.setValue("AvgTagWindow",500); if(!setup.contains("siteShift")) setup.setValue("siteShift",75); qint32 window=setup.value("AvgTagWindow").toInt(); qint32 half_window=0;//window/2; qint32 shift=setup.value("siteShift").toInt(); int c=0;//sense count, even/odd c sense/nonsense QMap<QString,int> poisson; QMapIterator<QChar,QMap<QString,QMap<qint32,qint32> > > sense(sql_input->genome); while(sense.hasNext()) { sense.next(); c++; QMapIterator<QString,QMap<qint32,qint32> > dictionary(sense.value()); while(dictionary.hasNext()) { dictionary.next(); QMapIterator<qint32,qint32> s(dictionary.value()); //sql result for strand+chromosome if((sam_input->genome['+']).contains(dictionary.key())) //chromosome chr1,chr2... { QMapIterator<qint32,qint32> k( (sam_input->genome['+'])[dictionary.key()] );//+ strand,sam file, iteration over strand+chromosome s.next(); //c++; k.next(); while (k.hasNext()) // + strand, iteration over strand+chromosome+each position { //if align is inside of the segment of the start site qint32 x1=k.key()- s.key() +half_window +shift; qint32 x2=x1-window; if( (x1^x2) < 0 ) {//inside segment poisson[((sql_input->genome_h[sense.key()])[dictionary.key()])[s.key()]]+=k.value(); k.next(); } else { if((k.key() +shift)>(s.key()+half_window)) { if(!s.hasNext()) break; s.next();// c++; } else { k.next(); } } }//while k.hasNext }//if + strand sam input if((sam_input->genome['-']).contains(dictionary.key())) { QMapIterator<qint32,qint32> j( (sam_input->genome['-'])[dictionary.key()] );//- strand,sam file s.toFront(); s.next(); j.next(); while (j.hasNext()) // - strand { //if align is inside of the segment of the start site qint32 x1=j.key()- s.key() +half_window -shift; qint32 x2=x1-window; if( (x1^x2) < 0 ) {//inside segment poisson[((sql_input->genome_h[sense.key()])[dictionary.key()])[s.key()]]+=j.value(); j.next(); } else { if((j.key() -shift)>(s.key()+half_window)) { if(!s.hasNext()) break; s.next(); } else { j.next(); } } } }//if - strand sam file }//while dictionary }//while sense //Poisson { qreal lamda=(qreal)(window*(sam_input->total-sam_input->notAligned))/(sam_input->tot_len*0.741); QFile _outFile; _outFile.setFileName(setup.value("outFileName").toString()); _outFile.open(QIODevice::WriteOnly|QIODevice::Truncate); qreal exp_l=qExp(-lamda); QString str; foreach(str,poisson.keys()) { //P(x,L)=(e**-1)*(L**x)/x! // qreal pois=exp_l; //qExp(-lamda)*qPow(lamda,poisson[str]); // for(int i=2; i<= poisson[str];i++) // pois=pois*lamda/i; //P(x,L)=(e**-1)*E(1-k)(L**x(i))/x(i)! qreal pois=exp_l; qreal delim=1.0; qreal sum=1.0; for(int i=1; i<= poisson[str];i++) { delim*=lamda/i; sum+=delim; } pois*=sum; _outFile.write( (QString("%1\t%2\t%3\n").arg(str).arg(poisson[str]).arg(pois,0,'e',20)).toLocal8Bit() ); } _outFile.flush(); _outFile.close(); }//if(1) }//end of function //------------------------------------------------------------- //-------------------------------------------------------------

ये छोटे एल्गोरिदम अधिक जटिल लोगों के कार्यान्वयन के लिए काम में आएंगे, उदाहरण के लिए, जैसे कि ZINBA या SICER । हम उनके बारे में एक अन्य लेख में बात करेंगे। अक्सर कार्य एनोटेशन के उपयोग के बिना समृद्ध क्षेत्रों को खोजना है। और फिर, चरण दर चरण, आपको उन डेटा का चयन करने की आवश्यकता है जो खिड़कियों में गिर गए और फ़िल्टर से गुज़रे।

स्ट्रैंड-विशिष्ट आरएनए अनुक्रमण विधियों का व्यापक तुलनात्मक विश्लेषण
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हिस्टोन संशोधन Chip-Seq डेटा से समृद्ध डोमेन की पहचान के लिए एक क्लस्टरिंग दृष्टिकोण।
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ZINBA डीएनए-सेक डेटा के साथ स्थानीय सहसंयोजकों को एकीकृत करता है, ताकि प्रवर्धित परमाणु क्षेत्रों के भीतर व्यापक और संकीर्ण क्षेत्रों की पहचान की जा सके।
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समीक्षा एंड्री कार्तशोव, सिनसिनाटी ओह, मेल: porter@porter.st द्वारा तैयार की गई है

व्यावहारिक जैव सूचना विज्ञान, भाग 3। प्रायोगिक डेटा के महत्व का आकलन

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