व्यावहारिक जैव सूचना विज्ञान, भाग 4। ZINBA के साथ काम करने के लिए तैयार हो रही है

डेटा विश्लेषण की आधुनिक दुनिया में, केवल एक विधि या केवल एक दृष्टिकोण का उपयोग करने का मतलब है कि जितनी जल्दी या बाद में आप इस तथ्य के पार आ जाएंगे कि आप कितने गलत थे। डेटा विश्लेषण के लिए विभिन्न तरीकों को जोड़ा जाता है, परिणाम की तुलना की जाती है, और तुलना के आधार पर अधिक सटीक पूर्वानुमान पहले से ही बनाए जाते हैं। ZINBA प्रोग्राम इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग करता है। डेवलपर्स ने एकल-पैकेज में डीएनए-सीक्यू प्रयोगों के विश्लेषण के लिए कई तरीकों को संयोजित किया है। यह पैकेज सांख्यिकीय डेटा प्रोसेसिंग प्रोग्राम R. के लिए लिखा गया है। ZINBA क्या करता है? यह उन मामलों में भी विभिन्न समृद्ध क्षेत्रों को खोजता है, जब उनमें से कुछ को प्रवर्धित किया गया था, उदाहरण के लिए, रासायनिक रूप से या सिग्नल-टू-शोर अनुपात का एक अलग डिग्री।

पहले मुझे ZINBA सॉफ्टवेयर उत्पाद के बारे में एक समीक्षा लेख बनाने की उम्मीद थी, लेकिन जितना अधिक मैं इसमें इस्तेमाल किए गए तरीकों के बारे में पढ़ता हूं, उतना ही गहरा मैं एल्गोरिदम और परिभाषाओं में खोदता हूं। और जब भविष्य में उन्होंने प्राप्त ज्ञान को रेखांकित किया, तो उन्होंने इस तथ्य को महसूस किया कि डेटा पहले से ही एक से अधिक लेखों पर एकत्र किया गया था और परिचय के बिना इस मुद्दे के सार को छूना मुश्किल होगा। इस विषय में, मैं ZINBA कार्यक्रम के वर्णन में वर्णित लेखों के संक्षिप्त अंश देता हूं, उन्हें अपनी टिप्पणियों के साथ पूरक करता हूं। मैं आपकी टिप्पणियों की प्रतीक्षा करूंगा ताकि सच्चाई की तह तक पहुंचा जा सके।
विनियामक जीव विज्ञान के लिए दूरगामी योजनाएं यह सीखना है कि जीनोम जीन अभिव्यक्ति के विभिन्न तंत्रों को कैसे कूटबद्ध करता है। कोडिंग और इन तंत्रों के बीच संबंध क्रोमेटिन इम्यूनोप्रूवेरिएशन ( चिप ) और जीन एक्सप्रेशन (RNA-seq) का उपयोग करके जीनोम में प्रोटीन बाइंडिंग साइटों को खोजने की संभावना से पता चलता है। साक्ष्य के लिए बहुत दूर जाने की आवश्यकता नहीं है; डीएनए एलीमेंट प्रोजेक्ट (ENCODE [1]) का विश्वकोश है, जिसके ढांचे के भीतर जीनोम के अधिकांश कार्यात्मक तत्वों को मान्यता दी गई है। माइक्रोएरे विधि का उपयोग करके पहले कदम उठाए गए थे, लेकिन गहरी डीएनए अनुक्रमण (चिप-सीक और डीएनए-सेक, कभी-कभी एनजीएस अगली पीढ़ी की अनुक्रमण शब्द का उपयोग किया जाता है) इस तकनीक के साथ पकड़ा गया और आगे निकल गया।
RNA-seq और ChIP-seq में निम्नलिखित सकारात्मक अंतर हैं: वे सटीकता, विशिष्टता, माप संवेदनशीलता को बढ़ाते हैं और आपको तुरंत पूरे जीनोम की जांच करने की अनुमति देते हैं। सामान्य तौर पर, आरएनए-सीक और चिप-सीक में पूर्ववर्ती के साथ कुछ समानताएं होती हैं जैसे कि माइक्रोचिप, लेकिन विवरण बहुत अलग हैं। लेकिन अनुक्रमण अभी भी कई कठिनाइयों से ग्रस्त है, हालांकि यह इन मामलों में माइक्रोचिप से काफी बेहतर है। इस तथ्य के कारण कि कटौती किए जा रहे डीएनए के टुकड़े बल्कि कम हैं, यह संभावना है कि टुकड़े जीनोम में कई बार हो सकते हैं, डीएनए के दोहराए जाने वाले हिस्से के हिस्से हो सकते हैं, या कुछ शुरुआत साइटों के लिए सामान्य टुकड़े हो सकते हैं।
यह माना जाता है कि डेटा प्रोसेसिंग को चिप प्रतिक्रिया को संवर्धन के रूप में मानना ​​चाहिए। क्योंकि तैयार डीएनए समाधान में लगभग 60-99% टुकड़े आमतौर पर पृष्ठभूमि होते हैं, और शेष 1-40% उन टुकड़ों से संबंधित होते हैं जिनके प्रोटीन एंटीबॉडी [2] को पार कर सकते हैं। यह समाधान का यह सबसे छोटा हिस्सा है जिसे अनुक्रमित किया जाएगा। तथ्य यह है कि संवर्धन की गणना करते समय प्रदूषण का स्तर अधिक होना चाहिए। कुछ मामलों में प्रति जीनोम पढ़ने की संख्या अतुलनीय रूप से छोटी है, उदाहरण के लिए, स्तनधारी जीनोम के लिए, रीड्स की संख्या कुल जीनोम लंबाई का 1% से कम है। सीक्वेंसिंग डेटा में स्पष्ट रूप से नए एल्गोरिदम और सॉफ़्टवेयर की आवश्यकता होती है।

अंजीर। 1

यह स्लाइड योजनाबद्ध रूप से चिप-सीक और आरएनए-सेक विश्लेषण के पदानुक्रम को दिखाती है। आमतौर पर, विश्लेषण नीचे से ऊपर के सभी चरणों से गुजरता है। विभिन्न कार्यक्रमों को सर्किट के प्रत्येक स्तर पर लागू किया जाता है और कभी-कभी विशेष रूप से चिप-सीक और आरएनए-सेक के लिए कार्यक्रमों में विभाजित किया जाता है। एक प्रोग्राम का आउटपुट दूसरे (पाइपलाइन) के लिए इनपुट है। जैसा कि आरेख से देखा जा सकता है, सभी प्रोग्राम पहले जीनोम (मैप्स रीड) पर रीड्स की परिभाषा से गुजरते हैं, जो ट्रांसक्रिप्शन के असेंबली के अपवाद के साथ होते हैं, जिसके परिणाम कथित ट्रांसक्रिप्शन होते हैं [3]। रीड्स जीनोम पर स्थित होने के बाद, इस तरह के कार्यक्रम का आउटपुट एग्रीगेट और पहचान कार्यक्रम के इनपुट पर प्रसारित होता है। उदाहरण के लिए, समृद्ध क्षेत्रों को निर्धारित करने के लिए या ज्ञात एनोटेशन पर घनत्व को पढ़ने के लिए। इसके अलावा, इन कार्यक्रमों में दोनों बाध्यकारी साइटों (डीएनए-सेक के लिए) और ट्रांसक्रिप्शन-आइसोफॉर्मिज़्म के नए अस्पष्टीकृत टुकड़े (चिप-सेक के लिए) के कुछ बाद के विश्लेषण शामिल हो सकते हैं। निम्नलिखित एक उच्च स्तरीय विश्लेषण है। इसमें रूढ़िवादी उद्देश्यों का निर्धारण या अभिव्यक्ति का स्तर शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप एक नए जीन मॉडल की खोज हो सकती है। एकीकरण स्तर (एकीकृत) से पता चलता है कि वर्तमान डेटा प्रसंस्करण के लिए, पहले प्राप्त परिणामों का उपयोग किया जा सकता है (जरूरी नहीं कि वर्तमान प्रयोग, प्रयोगशाला या देश के हिस्से के रूप में)।
तो जीनोम पर रीड्स पाए जाने के बाद हमें क्या मिलता है? यह डेटा कैसा दिखता है और वे एक दूसरे से कैसे भिन्न होते हैं? डीएनए पर बाध्यकारी साइटें हैं जिनसे एक या कोई अन्य प्रोटीन संलग्न हो सकता है; हम इन साइटों को बाध्यकारी साइट या बस साइट कहेंगे। उदाहरण के लिए, एक CTCF साइट का मतलब है कि इस क्षेत्र में एक CTCF प्रोटीन तय किया जा सकता है। वैज्ञानिकों ने CTCF प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी पाया है और एंटीबॉडी का उपयोग करने से डीएनए के संबंधित वर्गों को उपजी करने में सक्षम थे। लेकिन, जैसा कि हम पहले से ही जानते हैं, विशेष वर्गों के साथ मिलकर मनमाना एंटीबॉडी एंटीबॉडी से जुड़ सकते हैं। अन्य विधियां समान रूप से काम करती हैं: प्रोटीन डीएनए से जुड़ता है, एंटीबॉडी प्रोटीन से जुड़ता है, केवल डीएनए अनुभागों का चयन बदलता है। इस प्रकार, चयनित वर्गों की बारीकियों ने अपना निशान छोड़ दिया, और प्रत्येक विधि के लिए ड्राइंग के परिदृश्य का अपना होगा: कहीं संकीर्ण चोटियों, जैसा कि CTCF विधि में, ग्राफ a; एक बड़े आसन्न क्षेत्र के साथ कहीं खड़ी चोटियाँ, उदाहरण के लिए, आरएनए पोलीमरेज़ II विधि, ग्राफ बी; हिस्टोन संशोधन की वर्षा पर, एक निरंतर "फ्रिंज" प्राप्त किया जाता है, यह हिस्टोन की व्यवस्था की ख़ासियत के कारण है, चित्रा सी। रेखांकन पर, गुणसूत्र पर समन्वय एक्स अक्ष के साथ प्लॉट किया जाता है, और y अक्ष के साथ रीड्स का घनत्व। आंकड़े का डेटा [4] से लिया गया है।

अंजीर। 2

पृष्ठभूमि की उपस्थिति एल्गोरिदम को "नियंत्रण" पर आधारित अनुभवजन्य रूप से मूल्यांकन करने का प्रयास करने के लिए मजबूर करती है। नियंत्रण एक अतिरिक्त प्रयोग है जो विशेष (प्रारंभिक) एंटीबॉडी के साथ प्रारंभिक समाधान के साथ किया जाता है, जिसमें कुछ भी नहीं जुड़ना चाहिए, लेकिन फिर भी यादृच्छिक रूप से जुड़ता है। इस कनेक्शन का परिणाम कुछ मनमाना पृष्ठभूमि है। कुछ एल्गोरिदम एक संभावित पृष्ठभूमि का अनुकरण करते हैं, केवल नियंत्रण के बिना प्राप्त आंकड़ों के आधार पर। जो भी दृष्टिकोण चुना जाता है (नियंत्रण के साथ और बिना), पृष्ठभूमि रीड्स का वितरण पूरी तरह से एकीकृत नहीं किया जा सकता है, क्योंकि पृष्ठभूमि का स्तर उन दोनों प्रकार की कोशिकाओं और ऊतक पर निर्भर करता है जिनसे वे प्राप्त किए जाते हैं, और बयान पद्धति पर, आदि। । प्रवर्धन (पीसीआर) और अनुक्रमण के लिए एप्लाइड तकनीक भी कृत्रिम संवर्धन (कलाकृतियों) को जोड़ सकती है या एक से अधिक वर्गों को बढ़ा सकती है। ऐसे एल्गोरिदम हैं जो आपको प्रत्येक प्रयोग के लिए समृद्ध क्षेत्रों को खोजने की अनुमति देते हैं। यद्यपि प्रत्येक एल्गोरिदम प्रयोग के अनुरूप डेटा के लिए तेज किया जाता है, एल्गोरिथ्म अंतर्निहित अंतर्निहित धारणा हमेशा डीएनए-सीक [2] का उपयोग करके पाए गए समृद्ध क्षेत्रों के संभावित सेट पर फिट नहीं होती है।
नीचे, डेटा की तुलना करने के लिए, ZIMBA पर एक नए लेख से रेखांकन हैं। पहले और दूसरे आंकड़ों के बीच के पैमाने में अंतर के कारण इसी तरह के ग्राफ धुंधले होते हैं, लेकिन वे डीएनए-सीक तकनीक के बारे में उपरोक्त स्पष्टीकरण के अनुरूप दिखते हैं (चित्र 2 देखें)।


अंजीर। 3

पिछले ग्राफ़ के अलावा, अंजीर। 3 निम्न डीएनए-seq प्रयोगों के परिदृश्य को दर्शाता है: DNase- संवेदनशील नमूना (DNase-seq) [5] और फॉर्मलाडेहाइड (FAIRE-seq [6] का उपयोग करके प्रोटीन अलगाव / निर्धारण।
डीएनए एक दोहरा हेलिक्स है। यह वाक्यांश अपने आप में लोकप्रिय है, लेकिन इसे अक्सर भुला दिया जाता है। हमारे मामले में इसका क्या मतलब है? और तथ्य यह है कि जो प्रोग्राम जीनोम पर रीड्स की खोज करेगा, वह गुणसूत्र पर निर्देशांक के साथ, और सर्पिल (स्ट्रैंड) के इस पक्ष को पढ़ेगा। सर्पिलों को सकारात्मक (ज्ञान) और असंवेदनशील (निरर्थक / विरोधी) में विभाजित किया गया है। नरकट प्राप्त करने का तंत्र ऐसा है कि अधिकांश नरकट डीएनए से जुड़े प्रोटीन के सापेक्ष दो अलग-अलग पक्षों पर स्थित होंगे। इसके अलावा, ज्यादातर मामलों में, रीड्स सर्पिल के 5 'छोर पर स्थित होंगे। इसलिए, दोनों पक्षों पर पढ़े जाने वाले प्रोटीन बाध्यकारी साइट के केंद्र की ओर बढ़ेंगे। चित्रा 4 यह योजनाबद्ध रूप से दिखाता है, लाल डॉट्स 5 'छोर से पढ़े जाते हैं, और केंद्र में डीएनए से जुड़ा प्रोटीन होता है।


अंजीर। 4

इस प्रकार, प्रोटीन-डीएनए बाध्यकारी साइट के केंद्र को खोजने के लिए, हम निम्नलिखित ग्राफ का निर्माण करते हैं। ऐसा करने के लिए, "y" अक्ष पर, हम सकारात्मक और नकारात्मक पक्षों के बीच अंतर की संख्या को "x" अक्ष पर पोस्टपोन करते हैं, हम क्रोमोसोम के अनुरूप रीड समन्वय को स्थगित करते हैं। चित्रा 5 में, सकारात्मक पक्ष पर लाल और नकारात्मक पक्ष पर नीले रंग में दिखाया गया है। परिणामस्वरूप ग्राफ प्रोटीन बाइंडिंग साइट के केंद्र के करीब शून्य को पार कर जाता है (चित्र 5 का निचला ग्राफ देखें)। एल्गोरिदम मौजूद हैं, जो न्यूक्लियोटाइड तक, बाध्यकारी साइटों को निर्धारित करता है।

अंजीर। 5

इस विषय में, मैंने उस सामग्री को संक्षेप में प्रस्तुत करने का प्रयास किया जो अनुसंधान का विषय है। इसी डीएनए-सेक् प्रयोगों के परिदृश्य में अंतर दिखाए गए थे, और प्रोटीन बाध्यकारी साइट के केंद्र को खोजने के लिए एक विधि के बारे में बताया गया था। आगे एक बड़ा काम निहित है: हमें परिदृश्य के आधार पर एल्गोरिदम के बीच के अंतरों को समझना होगा, चोटियों को खोजना सीखें और उन्हें कृत्रिम लोगों से अलग करने की कोशिश करें, पता करें कि शिखर के आसपास के क्षेत्र में स्थित जीनोम के कौन से क्षेत्र समृद्ध माने जा सकते हैं, और यह सब ZINBA के काम के बारे में चर्चा शुरू करने के लिए किया जाता है। ।

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समीक्षा एंड्री कार्तशोव, सिनसिनाटी, ओएच, पोर्टर@ रिपोर्टर.st द्वारा तैयार की गई है
Ekaterina Morozova, ekaterina@porter.st द्वारा सही किया गया।