व्यावहारिक जैव सूचना विज्ञान, भाग 5। डीएनए अनुक्रमण

सबसे कठिन के बारे में बात करने के प्रयास में, जितनी जल्दी हो सके, जाहिर है आप सबसे सरल के बारे में भूल जाते हैं। और, मेरे मामले में, न केवल एक साधारण के बारे में, बल्कि एक महत्वपूर्ण लिंक के बारे में भी। कारण संबंध थोड़ा टूट गया है। मेरे पिछले लेखों ( 1 , 2 , 3 , 4 ) में गणितीय पहलू और प्रोग्रामिंग का वर्णन किया गया है, लेकिन उनके पास व्यावहारिक रूप से कोई जीव विज्ञान नहीं है। इसलिए, यह लेख आणविक जीव विज्ञान के किस भाग के बारे में है जो वे मेरे द्वारा वर्णित कार्यक्रमों और एल्गोरिदम को खोजने, भविष्यवाणी करने, देखने और हल करने की कोशिश कर रहे हैं।



सतह पर एक अंडे और शुक्राणु की छवि के साथ ड्राइंग उस चरण का प्रतीक है जिसे मैंने याद किया, जब सब कुछ बस उभर रहा है। एक दिलचस्प तथ्य यह है कि दो कोशिकाओं का मिलन मानव शरीर में लगभग 10 ट्रिलियन कोशिकाओं को जन्म देता है।

चलो आणविक जीव विज्ञान में एक छोटे से भ्रमण के साथ शुरू करते हैं। मैं सरल शब्दों में जटिल चीजों का वर्णन करने की कोशिश करूंगा, विवरणों को छोड़ देना। डीएनए सेल में है। हम बिल्कुल डीएनए और उस पर होने वाली प्रक्रियाओं पर विचार कर रहे हैं; हम बिलकुल उस जगह नहीं हैं जहाँ यह सेल में स्थित है। यह स्पष्ट करना आवश्यक है कि मेरे द्वारा काम करने वाले यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए उदाहरण दिए जाएंगे, लेकिन सबसे अधिक संभावना है कि कई चीजें प्रोकैरियोटिक के लिए भी काम करेंगी।

सेल में सभी प्रक्रियाएं डीएनए से शुरू होती हैं, यह डीएनए है जिसमें न्यूक्लियोटाइड्स के अनुक्रम होते हैं , जिसकी प्रतिलिपि भविष्य में कोशिकाओं में होने वाली प्रतिक्रियाओं और परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार होती है। हम प्रतिलिपि प्रक्रिया में रुचि रखते हैं जिसे प्रतिलेखन कहा जाता है । प्रतिलेखों की प्रतिलिपि बनाने और प्राप्त अंतिम उत्पादों की मात्रा को जीन अभिव्यक्ति कहा जाता है। लेकिन हम जीन अभिव्यक्ति को कहते हैं और प्रतिलेख की प्रतियों की संख्या की सटीक माप करते हैं (प्राप्त अंतिम उत्पादों की संख्या की परवाह किए बिना)।

निम्नलिखित जीवविज्ञान पाठ्यपुस्तक से एक चित्रण है जिसे "एक कोशिका में होने वाली चार बुनियादी आनुवंशिक प्रक्रियाएं" कहा जाता है (चित्र 1 देखें)। मैं वर्तमान में संख्या 1 और 2 के बीच इस आंकड़े में चित्रित प्रक्रियाओं पर काम कर रहा हूं। जो तकनीकें उन्हें सीखने में मदद करती हैं उन्हें डीएनए-सीक्यू और आरएनए-सीक कहा जाता है। इन तकनीकों का उपयोग व्यक्तिगत और संयुक्त रूप से किया जा सकता है। इस लेख में मैं डीएनए-सीक के तंत्र पर अधिक विस्तार से बताऊंगा।



अंजीर। 1

DNA-seq के विशेष मामले के रूप में, "DNA-seq Pol II" पर विचार करें (" ZINBA के साथ काम करने के लिए तैयार होना " भी देखें)। इसकी सहायता से प्राप्त परिणाम की समझ प्रतिलेखन की प्रक्रिया पर आधारित है। प्रतिलेखन की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका आरएनए पोलीमरेज़ प्रोटीन ( आरएनए पॉलीमरेज़ ) द्वारा निभाई जाती है। पॉलिमरेज़ एक विशेष डीएनए साइट (चित्र 2.1 देखें) पर तय किया गया है, जिसे प्रमोटर कहा जाता है। जबकि प्रतिलेखन प्रक्रिया की प्रारंभिक प्रक्रिया होती है (आरंभ चरण), पोलीमरेज़ प्रमोटर से जुड़ा रहता है। पोलीमरेज़ साइट की शुरुआत से ऊपरी हेलिक्स की एक प्रति बनाना शुरू कर देता है (प्रतिलिपि श्रृंखला की शुरुआत, आंकड़े में एक नीली डॉट द्वारा इंगित की गई)। फिर, लगभग 1000 ठिकानों की गति (37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर) की गति से आगे बढ़ते हुए, यह डीएनए के एक हिस्से को स्टॉप साइट पर कॉपी करता है (कॉपी की गई श्रृंखला का अंत आकृति में लाल बिंदु द्वारा दर्शाया गया है)। मैं एक बार फिर जोर देता हूं कि प्रमोटर की स्थिति में, पोलीमरेज़ ज्यादातर समय, और प्रतिलिपि किए गए डीएनए के प्रत्येक साइट पर कम स्थित होता है। आगे के अध्ययन के लिए, वैज्ञानिक प्रमोटर और स्टार्ट साइट में रुचि रखते हैं, जो प्रतिलेखन की शुरुआत के लिए एक आवश्यक शर्त है। प्रमोटर में प्रतियों की संख्या के बारे में भी जानकारी होती है, जो अध्ययन का एक महत्वपूर्ण उद्देश्य भी है।

बयान के साथ डीएनए-सीक पोल II प्रक्रिया कई चरणों में होती है: 1. हम रासायनिक या थर्मली रूप से पोलीमरेज़ की वर्तमान स्थिति को ठीक करते हैं (पोलीमरेज़ को ठीक करने का मतलब है कि प्रक्रियाएं बंद हो गई हैं, पोलीमरेज़ डीएनए के साथ अधिक स्थानांतरित नहीं होता है); 2. हम एक अनियंत्रित तरीके से अल्ट्रासाउंड (अल्ट्रासाउंड, MNase , आदि) में कटौती करते हैं (ज्यादातर मामलों में, पोलीमरेज़ द्वारा असुरक्षित डीएनए वर्गों को काट दिया जाता है); 3. क्रोमैटिन इम्युनोप्रेग्रेशन (एंटीबॉडी जो पोल II को छोड़कर अन्य सभी प्रोटीनों के लिए प्रतिरक्षा हैं) का उपयोग करके, हम उन क्षेत्रों का चयन करते हैं जिनमें पॉलीमरेज़ होते हैं। परिणामस्वरूप, हमें लगभग 150 ठिकानों के टुकड़े मिलते हैं, जिन्हें हम बाद में सीक्वेंसर को भेजेंगे। यह जोर दिया जाना चाहिए कि पोलीमरेज़ काटने किनारों पर सख्ती से नहीं होता है। इस प्रकार, प्रक्रिया निम्नानुसार है: हमने विभिन्न कोशिकाओं, फिक्स्ड पॉलीमरेज़ से एक ही डीएनए के लाखों तैयार किए, जिनमें से अधिकांश प्रमोटर पर स्थित हैं, और कुछ को यादृच्छिक रूप से जीन पर वितरित किया जाता है। वर्णित प्रक्रिया के डिजिटलीकरण का परिणाम हम निम्नलिखित आंकड़े में देखते हैं, एक लेख में दिया गया है (चित्र 3 देखें)। प्रस्तावित प्रमोटर (उच्च घनत्व रीड्स) को परिभाषित करने वाले रीड हरे रंग में परिचालित होते हैं, और इसके पीछे गति में पोलीमरेज़ के समान कम घनत्व रीड होते हैं।




अंजीर। 3
आगे, मैं कुछ अन्य प्रोटीनों के बारे में संक्षेप में बात करूंगा। चित्र 4 के ऊपरी भाग में, आप देख सकते हैं कि डीएनए कैसे पैक किया जाता है (चित्र 4.1 देखें।), और चित्र के निचले हिस्से में ऊपर वर्णित प्रतिलेखन प्रक्रिया अधिक विवरण में वर्णित है (चित्र। 4.2 देखें।)। जैसा कि चित्र 4.1 में देखा जा सकता है। डीएनए पैकेजिंग बहुत घनी है, एक डबल हेलिक्स न्यूक्लियोसोम के आसपास घाव है, डीएनए स्ट्रैंड की लंबाई लगभग 146 आधार है। न्यूक्लियोसम में प्रोटीन - हिस्टोन होते हैं। हिस्टोन में विभिन्न संशोधन हो सकते हैं, हिस्टोन का संशोधन एक विशाल अलग लेख का विषय है। हिस्टोन के एक विशिष्ट संशोधन के लिए एंटीबॉडी विकसित की जाती हैं, और यह ठीक डीएनए के अनुभाग हैं जो हिस्टोन के इस संशोधन के चारों ओर लिपटे हुए हैं जो कि पहले से फ़िल्टर किए गए (फ़िल्टर्ड) होंगे। यहां एक संशोधन संकेतन का एक उदाहरण दिया गया है: H3K4Me3। यह हिस्टोन एच 3 की चौथी स्थिति में लाइसिन के ट्राइमेथाइलेशन के रूप में पढ़ेगा। हिस्टोन के ऐसे कई संशोधन हो सकते हैं, और उनमें से सभी डीएनए द्वारा बिखरे हुए हैं, इसलिए, लेख "चित्रा 2 में ZINBA के साथ काम करने के लिए तैयार होना ", जो H3K27Me3 के परिदृश्य को दर्शाता है (हिस्टोन 3 के लिसिन 27 का ट्राइमेथाइलेशन), चोटियों का लगातार ढेर देखा जाता है।

डीएनए-सीक प्रौद्योगिकियां बिना वर्षा के मौजूद होती हैं, जब डीएनए को बस काट दिया जाता है, उदाहरण के लिए, एक DNase एंजाइम का उपयोग करके, और हमें बड़ी संख्या में टुकड़े मिलते हैं। ज्यादातर मामलों में, टुकड़े नाभिक के चारों ओर लिपटे घुमावों के अनुरूप होंगे, क्योंकि उनके बीच DNase कट होता है। परिणामस्वरूप टुकड़े सीक्वेंसर को भेजे जाते हैं। यह माना जाता है कि गहरी अनुक्रमण (टुकड़ों की एक बड़ी संख्या, लगभग 100 मिलियन रीड्स, सीक्वेंसर पर जाते हैं, जबकि यह एक महंगी खुशी है), कोई यह पहचान सकता है कि प्रोटीन परिणामी परिदृश्य से कहां है। इसके अलावा, परिदृश्य ज्वालामुखी की तरह दिखाई देगा, शीर्ष पर एक छोटा अवसाद गिलहरी के अनुरूप होना चाहिए। सबसे अधिक बार, DNase विधि का उपयोग डीएनए क्षेत्रों को खोजने के लिए किया जाता है जो इस एंजाइम के प्रति संवेदनशील होते हैं, अर्थात। उन क्षेत्रों में जो सबसे अच्छा काट रहे हैं।



अंजीर। 4
आंकड़े के निचले भाग में, हम आरएनए पोलीमरेज़, साथ ही बहु-रंगीन बादलों और अंडाकारों को देखते हैं, इसमें और डीएनए पर रखा गया है। इन अतिरिक्त तत्वों को प्रतिलेखन कारक कहा जाता है, वे जीन अभिव्यक्ति के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। प्रतिलेखन कारक दोनों अन्य प्रतिलेखन कारकों को जोड़ने की संभावना को बढ़ा या घटा सकते हैं, जिससे अभिव्यक्ति के नियमन में प्रमुखता आ सकती है। वे भी प्रोटीन हैं। अन्य सभी प्रोटीनों की तरह, उनके लिए एंटीबॉडी विकसित की जाती हैं। एक प्रतिलेखन कारक के उदाहरण के रूप में CTCF प्रोटीन को लेते हैं, इसकी एक भूमिका अन्य प्रतिलेखन कारकों के कार्य को रोकना है। इसके साथ DNA-seq प्रयोगों को " ZINBA के साथ काम करने के लिए तैयार होना " लेख में वर्णित किया गया है, इसी CTCF क्रोमेटिन इम्यूनोप्रूवमेंट परिदृश्य को निम्न आकृति में देखा जा सकता है। जैसा कि आप देख सकते हैं, इस प्रोटीन द्वारा संरक्षित क्षेत्र छोटे हैं, इसलिए आसपास के क्षेत्र में प्रसार अधिक नहीं है, केवल 150-200 बीपीपी।

डीएनए-सीक प्रयोगों (अनुक्रमण विधियों) के प्रकारों की एक उदाहरण योजना:


अंजीर। 5
मैंने योजना को चार सशर्त स्तरों में तोड़ दिया। पहला स्तर फिक्सेशन है, इसे फॉर्मेल्डिहाइड के साथ या बिना बाहर किया जा सकता है। दूसरा स्तर डीएनए को काटने की विधि है। तीसरे स्तर का आकार द्वारा निस्पंदन किया जाता है, इसके अलावा, क्रोमेटिन इम्यूनोप्रूवेरेशन का उपयोग करके निस्पंदन किया जा सकता है। चौथा स्तर अनुक्रमण विधि है।

इस प्रकार, आयोजित किए गए प्रत्येक प्रकार के प्रयोग अनुक्रमण विधि से मेल खाते हैं। अनुक्रमण की विधि के आधार पर विभिन्न प्रकार के टुकड़े बनाए जाते हैं। उन प्रयोगों पर विचार करें जिनके परिणाम प्रोटीन युक्त टुकड़े हैं। प्रोटीन को टुकड़े के केंद्र में या टुकड़े के दो किनारों में से एक पर रखा जा सकता है। सीक्वेंसर पूरे सेगमेंट को डीकोड नहीं करता है, लेकिन प्रत्येक टुकड़े के सर्पिल के अंत में 5 'की तरफ से इसका एक छोटा सा हिस्सा है। डिकोड किए गए टुकड़ों को रीड कहा जाता है। चित्रा 6 में, प्रत्येक सर्पिल के 5 'छोर लाल डॉट्स के साथ चिह्नित हैं। नीले और लाल तीर पढ़े जाने की शुरुआत को चिह्नित करते हैं। ये शुरुआत प्रत्येक हेलिक्स के 5 'छोर से प्रोटीन की सीमा तक यादृच्छिक रूप से वितरित की जाती है।


अंजीर। 6


बहुत से प्रारंभिक अणु प्रयोग में भाग लेते हैं, उनका डीएनए एक निश्चित प्रोटीन पड़ोस में काटा जाता है, जब कई रीड को समन्वित अक्ष (प्रोटीन में से एक) पर प्रदर्शित किया जाता है, इस तरह की एक तस्वीर प्राप्त की जाती है:


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समन्वित अक्ष (गहरा नीला) के ऊपर, ऊपरी सर्पिल ("+" स्ट्रैंड) से पढ़ता है और अक्ष के नीचे (हल्का नीला) नीचे सर्पिल ("-" स्ट्रैंड) से पढ़ा जाता है। यह कहना कि प्रोटीन कहाँ असंभव था, यह माना जाता है कि प्रोटीन बंधन केंद्र इन दो चोटियों के बीच स्थित है।

परिणामस्वरूप छवि एक संकेत जैसा दिखता है, और इसलिए संकेतों के विश्लेषण के लिए कुछ एल्गोरिदम डेटा पर लागू होने लगे, जिनमें से एक को इस लेख में वर्णित किया गया है habrahabr.ru/blogs/algorithm/135281 - "छिपे हुए मार्कोव मॉडल क्या हैं"।

मुझे उम्मीद है कि इस लेख के बाद विषय अधिक स्पष्ट हो गया है, और आगे के अध्ययन से मामूली आतंक नहीं होगा। यदि किसी को सामग्री की अधिक विस्तृत प्रस्तुति में दिलचस्पी है, तो लोदीश द्वारा संपादित एक अद्भुत आणविक कोशिका जीव विज्ञान पुस्तक है, जिसमें आणविक जीव विज्ञान के मूल तत्व बहुत जानकारीपूर्ण और सुलभ हैं, कुछ चित्रण से उधार लिया गया है।
समीक्षा एंड्री कार्तशोव, सिनसिनाटी, ओह, पोर्टर@ रिपोर्टर.st द्वारा तैयार की गई है।