जैव सूचना विज्ञान फिर से: जीवाणु जीनोम की विधानसभा

जैव सूचना विज्ञान पर पहला समीक्षा लेख प्रकाशित किए लगभग एक वर्ष बीत चुका है। मैं अधिक बार लिखना चाहूंगा, लेकिन सिर्फ जैव सूचना विज्ञान विचलित है और अनुमति नहीं देता है। पिछले लेख में, जीनोम को इकट्ठा करने के कार्य का उल्लेख किया गया था, साथ ही साथ अल्गोरिथमिक बायोलॉजी ( SPABAU RAS ) की प्रयोगशाला, जिसमें वे लगे हुए हैं। जैसा कि पहले ही उल्लेख किया गया है, दुनिया के कई विश्वविद्यालय लंबे समय से और काफी सफलतापूर्वक इस कार्य पर काम कर रहे हैं। हालांकि, जीनोम को इकट्ठा करने के लिए, जीवविज्ञानी विभिन्न प्रकार के डेटा की एक बड़ी मात्रा प्राप्त करते हैं, जिनमें से प्रत्येक की अपनी विशेषताएं हैं। लगभग पांच साल पहले, एमडीए प्रौद्योगिकी दिखाई दी, जिसने बैक्टीरिया के अध्ययन में महान अवसर खोले। परिणाम एक डेटा प्रकार था जिसे एक नए जीनोमिक कलेक्टर की आवश्यकता थी। कुछ साल बाद इसे विकसित किया गया था, और स्टैनफोर्ड या मैसाचुसेट्स में नहीं, बल्कि सेंट पीटर्सबर्ग में युवा अकादमिक विश्वविद्यालय में। लेकिन पहले बातें पहले।

जीनोम विधानसभा फिर से

मूल अवधारणाओं को संक्षेप में याद करें। जीवविज्ञानी के लिए जीनोम लंबे डीएनए अणु होते हैं, जो चार प्रकार के न्यूक्लियोटाइड्स (एडेनिन, साइटोसिन, गुआनिन और थाइमिन) की दोहरी श्रृंखला होते हैं। उदाहरण के लिए, एक जीवाणु में एक डीएनए स्ट्रैंड की लंबाई लाखों न्यूक्लियोटाइड में मापी जाती है, जबकि मानव डीएनए की लंबाई लगभग 3 बिलियन है। जैव सूचना विज्ञान के लिए, जीनोम चार-वर्ण वर्णमाला {A, C, G, T} के ऊपर एक बड़ी रेखा है। “पढ़ें: पूरे डीएनए अणु पूरी तरह से असंभव है। आधुनिक प्रौद्योगिकियां यादृच्छिक स्थानों से लंबे कई सौ न्यूक्लियोटाइड को केवल छोटे टुकड़ों को पढ़ने की अनुमति देती हैं, और फिर भी त्रुटियों के साथ। इन टुकड़ों को रीड्स कहा जाता है, और पढ़ने की प्रक्रिया को अनुक्रमण कहा जाता है। एक प्रयोग में, कई दसियों या यहां तक ​​कि सैकड़ों लाखों रीडिंग बनाई जाती हैं। अगला, बायोइंफॉर्मेटिक्स जो जीनोमिक असेम्बलर्स विकसित करते हैं, इन रीडिंग से मूल अनुक्रम को बहाल करने की कोशिश करने वाले कार्यक्रम, नाटक में आते हैं। एक नियम के रूप में, कोडांतरक पूरे जीनोम को पुनर्प्राप्त करने में विफल होते हैं, लेकिन लाखों छोटी रीडिंग से वे दसियों हजार हज़ारों न्यूक्लियोटाइड्स लंबे समय तक अनुक्रम की अनुमति देते हैं। इस तरह के दृश्यों को पहले से ही जीवविज्ञानी द्वारा आगे अध्ययन किया जा सकता है।

जीनोम को इकट्ठा करने और उसका विश्लेषण करने की आवश्यकता किसे हो सकती है? उदाहरण के लिए, मानव जीनोम की विधानसभा प्रारंभिक अवस्था में शरीर में कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति निर्धारित करने में मदद कर सकती है। एक अन्य लक्ष्य तथाकथित वैयक्तिकृत दवा का संक्रमण है। यदि प्रत्येक व्यक्ति जीन जानता है, तो दवाओं और उपचार को न केवल लक्षणों के लिए निर्धारित किया जा सकता है, बल्कि उनकी आनुवंशिक विशेषताओं को भी ध्यान में रखा जा सकता है। व्यक्तिगत चिकित्सा अभी तक व्यापक नहीं हुई है, लेकिन कुछ क्लीनिक पहले से ही मरीज के जीनोम की अनुक्रमण के लिए सेवाएं प्रदान करते हैं। जीनोम पढ़ने की लागत लगातार गिर रही है, और नए विधानसभा एल्गोरिदम इसे तेजी से लागू करना संभव बनाते हैं। फिर भी, एक पूर्ण निदान के लिए अकेले मानव जीनोम पर्याप्त नहीं है। हम में से प्रत्येक में विभिन्न बैक्टीरिया की कई हजार प्रजातियां हैं जो बड़ी संख्या में आंतरिक प्रक्रियाओं में भाग लेती हैं और जीवन के लिए आवश्यक हैं। इन जीवाणुओं के जीनोम की असेंबली (मानव जीनोम की लंबाई से अधिक की कुल लंबाई) मानव शरीर के बेहतर अध्ययन की अनुमति देगा। हालांकि, उनकी सीक्वेंसिंग में मुश्किलें हैं।

इंसान से लेकर बैक्टीरिया तक

जीनोम का अनुक्रम करने के लिए, आपके पास पर्याप्त मात्रा में आनुवंशिक सामग्री होनी चाहिए - समान डीएनए अणु। एक मानक प्रयोग के लिए कई दसियों या सैकड़ों लाखों समान कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। मनुष्यों सहित बहुकोशिकीय जीवों के मामले में, यह कोई समस्या नहीं है, क्योंकि कई ग्राम लार में पर्याप्त मात्रा में आनुवंशिक सामग्री निहित है। बैक्टीरिया कोशिकाओं की समान मात्रा प्राप्त करना अधिक कठिन है - उन्हें प्रयोगशाला में उगाया जाना चाहिए। समस्या यह है कि सभी बैक्टीरिया सुसंस्कृत नहीं हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, मानव आंतों के अंदर बैक्टीरिया बड़ी कॉलोनियों में रहते हैं और एक दूसरे से अलग-अलग मौजूद और गुणा करने में सक्षम नहीं होते हैं। कॉलोनी से लिए गए एक जीवाणु की खेती करना असंभव है।

आज, कालोनियों में अप्रयुक्त बैक्टीरिया के अनुक्रमण के लिए दो मौलिक रूप से अलग-अलग दृष्टिकोण हैं। बायोटेक्नोलॉजिकल दृष्टिकोण से पहला, काफी सरल है, मेगनोजोमिक्स है। इसमें निम्नलिखित शामिल हैं: हम एक कॉलोनी लेते हैं, सभी बैक्टीरिया से डीएनए अणुओं का चयन करते हैं, उन्हें एक सीक्वेंसर में डालते हैं और पढ़ते हैं। नतीजतन, हम एक साथ कई अलग-अलग बैक्टीरिया के कई दर्जनों जीनोमों के रीडिंग प्राप्त करेंगे - कुछ से, कुछ कम से। बारीकी से संबंधित बैक्टीरिया में, जीनोम एक दूसरे के समान होते हैं, विभिन्न प्रकार के बैक्टीरिया में वे बहुत भिन्न होते हैं, लेकिन उनमें समान क्षेत्र हो सकते हैं। ये कारक इस तरह के डेटा के संग्रह को बहुत जटिल करते हैं। आज आयोजित और शुरू होने वाले मेटागोनोमिक अध्ययनों की संख्या के बावजूद, मैं यह नहीं कह सकता कि कम से कम एक कोडांतरक है जो ऐसे परिणामों का उत्पादन करेगा जो इस तरह के डेटा के आधार पर जीवविज्ञानी को संतुष्ट करते हैं। एक नियम के रूप में, कलेक्टर छोटे अनुक्रम उत्पन्न करते हैं जिनमें बड़ी संख्या में त्रुटियां होती हैं और विश्लेषण करना मुश्किल होता है। कभी-कभी, मेटागेनोमिक परियोजनाओं में, विभिन्न जीवाणुओं के पूरे सेट के लिए कई जीनों की खोज पहले से ही एक सफलता है।

अनुत्पादक जीवाणुओं के अनुक्रमण के लिए एक और दृष्टिकोण कुछ साल पहले ही खोजा गया था और इसमें एक जटिल जैव-प्रौद्योगिकीय प्रक्रिया शामिल थी। हम कॉलोनी से अपने लिए एक ब्याज का जीवाणु लेते हैं, उसमें से डीएनए निकालते हैं और डीएनए पर कई "कॉपी मशीनें" डालते हैं, जो अणु के चारों ओर "दौड़ना" शुरू करते हैं और उसके खंडों को यादृच्छिक रूप से कॉपी करते हैं। नकल करते समय, नए डीएनए अणु शाखा से अलग हो जाते हैं, जो बदले में "कॉपी मशीन" द्वारा भी लिया जा सकता है और आनुवंशिक सामग्री का निर्माण जारी रख सकता है। नतीजतन, हम जिस डीएनए में रुचि रखते हैं, उसकी समान प्रतियाँ प्राप्त करते हैं, जिन्हें हम सीक्वेंसर में डालते हैं। एकल-कोशिका जीनोम अनुक्रमण की इस विधि को मल्टीपल डिसप्लेसमेंट एम्प्लीफिकेशन (एमडीए) कहा जाता है। ऐसा लगेगा कि सब कुछ अद्भुत है। लेकिन, अफसोस, समस्याएं हैं। "कॉपी मशीनें" अपने दम पर काम करती हैं और इन्हें नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। इसलिए, डीएनए के कुछ वर्गों को दस हजार बार कॉपी किया जा सकता है, जबकि अन्य को कभी भी कॉपी नहीं किया जा सकता है। नतीजतन, कुछ क्षेत्र केवल सामग्री की कमी के कारण विधानसभा में अनुपस्थित होंगे। औसतन, इस पद्धति के परिणामस्वरूप, इसकी संरचना के आधार पर 95-99% जीनोम को बहाल करना संभव है (कुछ खुद को नकल करने के लिए बदतर उधार लेते हैं) और प्रयोग की गुणवत्ता।

एमडीए प्रौद्योगिकी मुद्दे

अनुक्रमण के दौरान एक जीनोम में एक न्यूक्लियोटाइड को पढ़ने की संख्या को इसकी कोटिंग कहा जाता है। मानक अनुक्रमण के साथ, सभी न्यूक्लियोटाइड्स का कवरेज लगभग समान होता है (नीचे दिए गए आंकड़े में कोटिंग की साजिश का एक उदाहरण)। एमडीए प्रौद्योगिकी का उपयोग करते समय, हम एक बेहद असमान कवरेज (नीचे सही आंकड़ा) के साथ डेटा प्राप्त करते हैं, जो विधानसभा कार्य के लिए एक महत्वपूर्ण समस्या है। आइए जानने की कोशिश करते हैं कि क्यों।



हम निम्नलिखित प्रयोग करेंगे। हम मानक अनुक्रमण का उपयोग करते हुए प्राप्त डेटा और एक निश्चित लंबाई k (बाद में - k- उपाय) के सभी रीडिंग सबस्ट्रिंग से अर्क लेते हैं, ताकि पढ़ने में प्रत्येक संभावित स्थिति से एक k-उपाय शुरू हो (इस तरह से, ACGTAC अनुक्रम चार 3-उपायों में विभाजित हो जाता है : एसीजी, सीजीटी, जीटीए और टीएसी)। इसके बाद, हम गणना करते हैं कि हमारे रीडिंग में प्रत्येक के-माप कितनी बार होता है। यदि एक निश्चित कश्मीर-माप पर्याप्त रूप से बड़ी संख्या में दिखाई देता है (अर्थात, इसकी उच्च कवरेज है), तो यह मानने का कारण है कि यह मूल जीनोम में भी होता है, जिसे हम अनुक्रमण कर रहे हैं। यदि k- मेर दुर्लभ है, तो यह सबसे अधिक संभावना है कि एक गलत तरीके से पढ़ा हुआ न्यूक्लियोटाइड है। सीक्वेंसिंग एरर एक रैंडम ईवेंट है, और बड़ी संख्या में के-उपायों के तुरंत बाद एक ही त्रुटि होने की संभावना बहुत कम होती है (एकल न्यूक्लियोटाइड की गलत रीडिंग की संभावना रीडिंग में न्यूक्लियोटाइड की स्थिति के आधार पर 0.001% से 1% तक होती है)। इस प्रकार, k- उपायों के कवरेज मूल्य का उपयोग करके, हम उन्हें विश्वसनीय और गलत में विभाजित कर सकते हैं। अधिकांश आधुनिक कोडांतरकों और उपयोगिताओं में इसी तरह के तरीकों का उपयोग रीडिंग में त्रुटियों को ठीक करने के लिए किया जाता है। हालांकि, एकल कोशिका अनुक्रमण के मामले में, इस तरह से के-उपायों को अलग करना असंभव है, क्योंकि के-उपाय, जो दुर्लभ हैं, क्षेत्र की एक छोटी संख्या की नकल कर सकते हैं और इसमें त्रुटियां बिल्कुल भी नहीं हैं।

एमडीए दृष्टिकोण के साथ असमान कवरेज एकमात्र समस्या नहीं है। डीएनए की नकल करते समय, मुख्य स्ट्रैंड से एक नया एकल-फंसे स्ट्रैंड शाखाएं। यह बेतरतीब ढंग से एक और नवोदित स्ट्रैंड के साथ एक साथ चिपक सकता है, जिसके कारण पास में डीएनए अनुक्रम होंगे, जो मूल जीनोम में पूरी तरह से अलग हिस्सों के अनुरूप हैं। इस तरह के गलत gluing के स्थान पर, "कॉपी मशीनें" फिर से बैठ सकती हैं और गलत अनुभाग का प्रचार कर सकती हैं। फिर, अनुक्रमण के परिणामस्वरूप, हम जीनोम के विभिन्न हिस्सों (काइमरिक रीडिंग) से अनुक्रम युक्त रीडिंग प्राप्त करते हैं। इस तरह के रीडिंग को संसाधित करते समय, जीनोमिक कलेक्टर गलत तरीके से दो अनुक्रमों को एक में जोड़ सकता है। यदि एक गलत तरीके से रखा न्यूक्लियोटाइड एक सकल त्रुटि नहीं है, तो दो गलत तरीके से सरेस से जोड़ा हुआ साइट बहुत अधिक गंभीर समस्या है, जो आगे के विश्लेषण को जटिल करता है।

अंत में

यह एमडीए प्रौद्योगिकी का उपयोग कर प्राप्त किया गया डेटा है जो सेंट पीटर्सबर्ग में एल्गोरिथम जीवविज्ञान की प्रयोगशाला में अनुसंधान का मुख्य विषय बन गया है। कई एल्गोरिदम विकसित किए गए थे जिन्होंने असमान कवरेज और चिमेरिकल रीडिंग की समस्याओं को दरकिनार किया था। इन एल्गोरिदम को जीनोम असेंबलर एसपीएड्स में लागू किया गया था, जो आज बैक्टीरिया जीनोम की विधानसभा में एक नेता है और इसका उपयोग अग्रणी वैश्विक प्रयोगशालाओं द्वारा किया जाता है (उदाहरण के लिए, संयुक्त राज्य अमेरिका में संयुक्त जीनोमिक संस्थान, जीवाणु जीनोम के अध्ययन के लिए दुनिया का सबसे बड़ा केंद्र)।

आगे, मैं ख़ुशी से आधुनिक मानक असेंबलरों के बुनियादी सिद्धांतों से पाठकों को परिचित कराऊँगा, मैं नए दृष्टिकोणों और एल्गोरिदम के बारे में बात करूँगा जिनका उपयोग किसी एकल कक्ष पर प्राप्त डेटा को इकट्ठा करने के लिए किया जाता है, लेकिन, दुर्भाग्य से, यह एक लेख में फिट नहीं होता है। उन लोगों के लिए जो विधानसभा एल्गोरिदम के बारे में अधिक जानने में रुचि रखते हैं - नीचे इस विषय पर लोकप्रिय ग्रंथों और वैज्ञानिक प्रकाशनों के लिंक दिए गए हैं। मुझे पूरी उम्मीद है कि इस तरह के अगले लेख इस बार की तुलना में तेजी से दिखाई देंगे।

रुचि के लिए

• "नकल मशीन" का कार्य Phi-29 डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा किया जाता है, एक प्रोटीन जो यादृच्छिक स्थानों में डीएनए के कुछ हिस्सों को दोहराने में सक्षम है।
• एमडीए का उपयोग करके प्राप्त आंकड़ों में अनुक्रमण त्रुटियों को निर्धारित करने और समाप्त करने के लिए, दृष्टिकोण पर आधारित, उदाहरण के लिए, हमिंग दूरी पर के-उपायों की क्लस्टरिंग, त्रुटियों के स्थानों में काउंट डी ब्रुइन की सामयिक विशेषताएं उपयोग की जाती हैं।
  
• गणना डी ब्रुइन की टोपोलॉजी के अनुसार काइमेरिक यौगिकों की खोज और निष्कासन भी मुख्य रूप से किया जाता है।

संदर्भ

• पीईसी कम्पू और पीए पेवेज़नर। जीनोम पुनर्निर्माण: एक पहेली बिलियन मोहरे के साथ ( जीनोम असेंबली रिव्यू)
• पीए Pevzner, एच। तांग, और एम। Waterman। डीएनए टुकड़ा विधानसभा के लिए एक यूलरियन पथ दृष्टिकोण। संयुक्त राज्य अमेरिका के नेशनल एकेडमी ऑफ साइंस की कार्यवाही, 98: 9748-9753, 2001 (जीनोम असेंबली के कार्य में काउंट डी ब्रुइन के उपयोग पर पहला लेख)
• डी। ज़र्बिनो, और ई। बिरनी। मखमली: डी ब्रूवन रेखांकन का उपयोग करते हुए डे नोवो शॉर्ट रीड असेंबली के लिए एल्गोरिदम। जीनोम रिसर्च। 18 (2008), 821–829 (क्लासिक असेम्बलर वेलवेट)
• ए। बैंकेविच, एस। नर्क, एट अल। एसपीएड्स: एक नई जीनोम असेंबली एल्गोरिथम और सिंगल-सेल सीक्वेंसिंग के लिए इसके अनुप्रयोग। कम्प्यूटेशनल बायोलॉजी 19 की पत्रिका (5) (2012), 455-477 (एसपीएड - एमडीए का उपयोग करके प्राप्त डेटा कोडांतरण के लिए कोडांतरक)